FPKM后续

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发布日期: 2024-10-09

恭喜你成功获得了 RNA-Seq 的 FPKM 表格！接下来可以进行一系列的分析，取决于你的研究目标。以下是一些常见的 RNA-Seq 下游分析步骤和方向：

1. 数据质量评估

在任何分析之前，首先需要对 FPKM 表进行质量评估，确保数据的可靠性和可用性。

样本聚类分析：
- 使用主成分分析（PCA）或聚类分析来查看不同样本之间的相似性，确保相同条件下的样本聚类在一起。
- 工具：R 语言中的 DESeq2、edgeR 包，或者 Python 中的 scikit-learn 进行 PCA 分析。
表达分布可视化：
- 生成基因表达的箱线图或密度图，查看整体表达的分布情况，寻找是否存在异常样本。
- 工具：R 中的 ggplot2 包或者 boxplot、violinplot。

2. 差异表达分析

如果你有不同的实验条件或组别，可以进行差异表达分析（Differential Expression Analysis，DEA），找出在不同条件下显著变化的基因。

选择合适的统计方法：
- 常用的工具有：
  - DESeq2（R）：处理 raw counts 数据，如果你只得到了 FPKM，也可以通过转换进行分析。
  - edgeR（R）：适用于 count 数据，适合小样本数量的研究。
  - limma+voom（R）：适用于 normalized 数据（如 FPKM 或 TPM），用于处理复杂的实验设计。
火山图和MA图：
- 生成火山图（Volcano plot）和 MA 图，展示差异表达基因的分布情况。火山图展示了基因的显著性和折叠变化，MA图展示了基因表达变化的趋势。
- 工具：R 的 ggplot2 或者 EnhancedVolcano 包。

3. 功能富集分析

差异表达基因列表（DEGs）可以用来进行基因集富集分析，找出这些基因背后的生物学功能或通路。

Gene Ontology (GO) 分析：
- 找出差异基因在分子功能（MF）、细胞组分（CC）、生物过程（BP）三个层次上是否富集了某些 GO term。
- 工具：clusterProfiler（R 包）、DAVID（网页工具）。
KEGG 通路富集分析：
- 使用 KEGG 分析基因在代谢通路、信号通路中的富集情况。
- 工具：clusterProfiler（R 包）、KOBAS（网页工具）。
GSEA 分析（Gene Set Enrichment Analysis）：
- GSEA 不需要设定差异基因的阈值，而是根据基因的排名分布进行富集分析，适合寻找整体的通路变化。
- 工具：GSEA 软件（Broad Institute 提供）、clusterProfiler（R 包支持 GSEA 分析）。

4. 可视化

数据的可视化是关键，可以让你直观地理解差异表达基因及其富集结果。

**热图 (Heatmap)**：
- 用于展示差异表达基因在各个样本中的表达模式。可以通过样本的聚类来查看不同组别的相似性。
- 工具：pheatmap（R 包）、ComplexHeatmap（R 包）。
**火山图 (Volcano Plot)**：
- 展示差异基因的显著性和折叠变化。可以直观地看到哪些基因显著上调或下调。
- 工具：EnhancedVolcano（R 包）、ggplot2（R 包）。
通路网络图：
- 将基因富集分析的结果可视化为通路网络，展示不同通路之间的关联。
- 工具：Cytoscape 软件。

5. 验证分析

在找到差异表达基因后，通常需要验证其中一些候选基因的表达情况。常见的验证手段包括：

qPCR 验证：
- 选取部分差异表达基因进行实时定量 PCR（qPCR）验证，以确认 RNA-Seq 结果的准确性。
Western Blot 或 免疫组化：
- 如果有对应蛋白数据，可以进一步用 Western Blot 或免疫组化对候选基因进行蛋白水平的验证。

6. 其他高级分析

共表达网络分析：
- 构建基因共表达网络，分析基因之间的相关性。WGCNA（加权基因共表达网络分析）是一种常用的工具。
- 工具：WGCNA（R 包）。
miRNA/lncRNA 分析：
- 如果你有额外的 miRNA 或 lncRNA 数据，可以分析基因表达的调控网络，研究这些非编码 RNA 如何调控 mRNA 的表达。
- 工具：miRDB、miRTarBase。

7. 结果撰写和汇报

最后，在分析结束后，你需要将结果整理为科研报告或论文。常见需要展示的结果包括：

差异基因的列表。
基因功能富集的结果（GO、KEGG）。
关键基因的表达模式（热图、火山图）。
通路分析的图表（KEGG 通路图、GSEA 结果）。
验证实验的数据和图表。

总结

你已经生成了 FPKM 表格，下一步可以根据自己的研究问题选择适合的下游分析。一般来说，差异表达分析和功能富集分析是比较常见且关键的步骤。此外，数据的可视化和验证也是必不可少的部分。工具方面，R 是处理 RNA-Seq 数据的主流工具，有大量成熟的包可供使用，如 DESeq2、edgeR、clusterProfiler 等。如果你不熟悉编程工具，也可以使用一些在线平台（如 DAVID、KEGG）来进行部分分析。

如果你有更具体的分析需求，欢迎进一步探讨！

当然，我可以为你提供一个简单的 R 语言示例，帮助你完成 主成分分析（PCA） 和 基因表达分布的可视化。

假设你有一个 FPKM 表格，格式如下：

Gene ID	Sample1	Sample2	Sample3	Sample4
GeneA	2.5	3.1	1.2	4.5
GeneB	1.2	0.9	2.3	1.8
GeneC	3.8	4.2	2.1	5.3
…	…	…	…	…

一、样本聚类分析：PCA

PCA 是用来检查样本之间的相似性的重要手段。我们将基于 FPKM 值进行 PCA 分析。

1.1 加载数据和必要的 R 包

# 加载必要的R包
install.packages("ggplot2")
install.packages("FactoMineR")
install.packages("factoextra")

library(ggplot2)
library(FactoMineR)
library(factoextra)

# 读取FPKM数据，假设数据在csv文件中
data <- read.csv("FPKM_data.csv", row.names = 1)

# 转置数据，将样本作为行，基因作为列
data_t <- t(data)

# 进行PCA分析
pca_res <- PCA(data_t, graph = FALSE)

# 可视化PCA结果
fviz_pca_ind(pca_res,
             geom.ind = "point", 
             pointshape = 21,
             pointsize = 2,
             fill.ind = "lightblue",
             col.ind = "black",
             repel = TRUE) # 避免标签重叠

1.2 解释代码：

**read.csv("FPKM_data.csv")**：读取 FPKM 数据文件（请将 "FPKM_data.csv" 替换为你自己的文件路径）。
**t(data)**：转置数据矩阵，因为 PCA 需要样本作为行，基因作为列。
**PCA(data_t)**：进行 PCA 分析。
**fviz_pca_ind()**：绘制 PCA 图，fill.ind 和 col.ind 控制点的填充颜色和边框颜色。

1.3 结果：

运行此代码后，你将获得一个 PCA 图。样本会根据 PCA 的两个主成分进行投射，查看不同实验条件下的样本是否聚类在一起。如果相同组的样本聚类紧密，表示它们的基因表达模式相似。

二、表达分布可视化：箱线图和密度图

通过可视化基因表达的分布，可以查看不同样本中的基因表达情况，并判断是否有异常样本。

2.1 箱线图

# 基因表达数据可视化 (箱线图)
library(reshape2)

# 将数据转换为适合ggplot2的格式
data_melt <- melt(data)

# 生成箱线图
ggplot(data_melt, aes(x=variable, y=value)) +
  geom_boxplot(aes(fill=variable)) +
  theme_minimal() +
  xlab("Samples") +
  ylab("FPKM values") +
  ggtitle("Gene Expression Distribution (Boxplot)")

2.2 密度图

# 生成密度图
ggplot(data_melt, aes(x=value, fill=variable)) +
  geom_density(alpha=0.6) +
  theme_minimal() +
  xlab("FPKM values") +
  ylab("Density") +
  ggtitle("Gene Expression Distribution (Density Plot)")

2.3 解释代码：

**melt(data)**：将数据转换为适合 ggplot2 作图的格式。
**geom_boxplot()**：绘制箱线图，展示不同样本中基因表达的分布。
**geom_density()**：绘制密度图，展示不同样本的基因表达密度分布。

2.4 结果：

运行此代码后，你将获得每个样本的基因表达分布图（箱线图和密度图）。这些图可以帮助你识别潜在的异常样本。如果某个样本的分布明显偏离其他样本，可能需要进一步检查该样本。

总结

PCA 分析：用于查看样本间的相似性。通过 PCA 图可以判断样本是否在相同条件下聚类在一起。
表达分布可视化：使用箱线图和密度图可以直观地查看样本的基因表达分布，帮助识别异常样本。

这些步骤是 RNA-Seq 数据质量评估的重要组成部分。如果你有更多问题，或者需要更详细的示例，可以进一步讨论！

当然！下面分别是为 PCA 分析 和 表达分布可视化 制作的两个 Shiny 应用的示例代码。你可以运行这些代码来交互式地分析和可视化你的 FPKM 数据。

1. PCA 分析 ShinyApp

首先，确保你已经安装了 shiny、ggplot2、FactoMineR 和 factoextra 包。

# 安装必要的包（如果还未安装）
install.packages("shiny")
install.packages("ggplot2")
install.packages("FactoMineR")
install.packages("factoextra")

# 运行PCA分析的Shiny应用
library(shiny)
library(FactoMineR)
library(factoextra)
library(ggplot2)

# PCA Shiny App
ui <- fluidPage(
  titlePanel("PCA Analysis of RNA-Seq FPKM Data"),
  
  sidebarLayout(
    sidebarPanel(
      fileInput("file1", "Choose CSV File",
                accept = c("text/csv", "text/comma-separated-values,text/plain", ".csv")),
      checkboxInput("header", "Header", TRUE),
      actionButton("go", "Run PCA")
    ),
    
    mainPanel(
      plotOutput("pcaPlot")
    )
  )
)

server <- function(input, output) {
  
  observeEvent(input$go, {
    req(input$file1)
    
    data <- reactive({
      file <- input$file1
      read.csv(file$datapath, header = input$header, row.names = 1)
    })
    
    output$pcaPlot <- renderPlot({
      df <- data()
      df_t <- t(df)
      
      pca_res <- PCA(df_t, graph = FALSE)
      fviz_pca_ind(pca_res, geom.ind = "point", pointshape = 21, pointsize = 2,
                   fill.ind = "lightblue", col.ind = "black", repel = TRUE)
    })
  })
}

# 运行应用
shinyApp(ui, server)

说明：

文件输入：用户可以上传 FPKM 数据的 .csv 文件。
主成分分析：运行 PCA，并生成一个交互式的主成分分析图。
可视化：fviz_pca_ind 用于绘制 PCA 图。

2. 表达分布可视化 ShinyApp

这段代码用于显示基因表达数据的箱线图和密度图。

# 安装必要的包（如果还未安装）
install.packages("shiny")
install.packages("ggplot2")
install.packages("reshape2")

# 运行表达分布可视化的Shiny应用
library(shiny)
library(ggplot2)
library(reshape2)

# Boxplot and Density Plot Shiny App
ui <- fluidPage(
  titlePanel("Gene Expression Distribution Visualization"),
  
  sidebarLayout(
    sidebarPanel(
      fileInput("file1", "Choose CSV File",
                accept = c("text/csv", "text/comma-separated-values,text/plain", ".csv")),
      checkboxInput("header", "Header", TRUE),
      selectInput("plotType", "Select Plot Type", choices = c("Boxplot", "Density Plot")),
      actionButton("go", "Generate Plot")
    ),
    
    mainPanel(
      plotOutput("distPlot")
    )
  )
)

server <- function(input, output) {
  
  observeEvent(input$go, {
    req(input$file1)
    
    data <- reactive({
      file <- input$file1
      read.csv(file$datapath, header = input$header, row.names = 1)
    })
    
    output$distPlot <- renderPlot({
      df <- data()
      df_melt <- melt(df)
      
      if (input$plotType == "Boxplot") {
        ggplot(df_melt, aes(x = variable, y = value)) +
          geom_boxplot(aes(fill = variable)) +
          theme_minimal() +
          xlab("Samples") +
          ylab("FPKM values") +
          ggtitle("Gene Expression Distribution (Boxplot)")
      } else if (input$plotType == "Density Plot") {
        ggplot(df_melt, aes(x = value, fill = variable)) +
          geom_density(alpha = 0.6) +
          theme_minimal() +
          xlab("FPKM values") +
          ylab("Density") +
          ggtitle("Gene Expression Distribution (Density Plot)")
      }
    })
  })
}

# 运行应用
shinyApp(ui, server)

说明：

文件输入：用户可以上传 FPKM 数据的 .csv 文件。
选择图类型：用户可以选择生成箱线图（Boxplot）或者密度图（Density Plot）。
生成图形：应用程序根据用户选择生成相应的表达分布图。

如何运行 Shiny 应用：

保存文件：将上述代码分别保存为两个 .R 文件，例如 pca_app.R 和 distribution_app.R。

运行应用：在 RStudio 或 R 环境中运行命令：

1 2	source("pca_app.R") # 启动 PCA 分析的 Shiny 应用 source("distribution_app.R") # 启动表达分布可视化的 Shiny 应用

在这两个应用中，你可以交互式地上传 FPKM 数据，并查看 PCA 分析结果和表达分布的可视化图。

如果你有更多问题或者需要进一步的帮助，欢迎随时讨论！

花粱

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2024-10-21 花粱

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1. 数据质量评估

2. 差异表达分析

3. 功能富集分析

4. 可视化

5. 验证分析

6. 其他高级分析

7. 结果撰写和汇报

总结

假设你有一个 FPKM 表格，格式如下：

一、样本聚类分析：PCA

1.1 加载数据和必要的 R 包

1.2 解释代码：

1.3 结果：

二、表达分布可视化：箱线图和密度图

2.1 箱线图

2.2 密度图

2.3 解释代码：

2.4 结果：

总结

1. PCA 分析 ShinyApp

说明：

2. 表达分布可视化 ShinyApp

说明：

如何运行 Shiny 应用：

你的赏识是我前进的动力