转录组软件

图一

先运行一下

你提到的几个软件（如 HISAT2, SAMtools, sratoolkit, StringTie, subread）是用于 RNA-Seq 数据处理的工具链。以下是一个完整的 RNA-Seq 转录组分析工作流程，包括这些工具的使用。

RNA-Seq 工作流程概述

RNA-Seq 的标准分析流程通常包括以下步骤：

1. 数据准备：下载或准备原始序列数据（通常为 FASTQ 格式）。
2. 比对：将序列比对到参考基因组上（通常使用 HISAT2）。
3. SAM/BAM 处理：使用 SAMtools 将比对结果处理为 BAM 格式并排序。
4. 表达定量：使用 StringTie 对转录组数据进行组装和表达定量。
5. 下游分析：如差异表达分析，使用 subread 或其他工具。

1. 数据准备（使用 sratoolkit 下载数据）

如果你需要从 NCBI 的 SRA 数据库下载 RNA-Seq 数据，可以使用 sratoolkit 提供的 fastq-dump 命令。

示例：

# 使用 sratoolkit 下载 SRA 数据并转换为 FASTQ 文件
fastq-dump --split-files SRRXXXXXXX  # SRRXXXXXXX 是 SRA 数据的 accession number

这将下载 SRA 文件，并将其拆分为一个或两个（单端或双端） FASTQ 文件。

2. 比对序列到参考基因组（使用 HISAT2）

HISAT2 是一种用于 RNA-Seq 数据比对的工具。你需要一个索引过的参考基因组，首先使用 hisat2-build 构建索引。

构建基因组索引：

hisat2-build reference_genome.fasta reference_index

比对 FASTQ 文件到参考基因组：

# 单端测序数据
hisat2 -x reference_index -U reads.fastq -S output.sam

# 双端测序数据
hisat2 -x reference_index -1 reads_1.fastq -2 reads_2.fastq -S output.sam

• reference_index 是用 hisat2-build 生成的索引前缀。
• reads.fastq 是你的 FASTQ 文件。
• output.sam 是比对后的结果。

3. 处理 SAM 文件（使用 SAMtools）

比对完成后，HISAT2 会生成一个 SAM 文件，接下来使用 SAMtools 将其转换为 BAM 格式，并进行排序。

转换为 BAM 文件：

samtools view -bS output.sam > output.bam

排序 BAM 文件：

samtools sort output.bam -o sorted_output.bam

创建 BAM 索引：

samtools index sorted_output.bam

4. 表达定量（使用 StringTie）

比对结果准备好后，可以使用 StringTie 进行转录组组装和表达定量。

转录组组装和定量：

stringtie sorted_output.bam -G reference_annotation.gtf -o output.gtf

• sorted_output.bam 是经过排序的 BAM 文件。
• reference_annotation.gtf 是参考的基因组注释文件（GTF 格式）。
• output.gtf 是输出的转录组组装结果。

5. 差异表达分析（使用 subread）

subread 提供了 featureCounts 命令来对比对结果进行定量，通常用于生成差异表达分析所需的计数矩阵。

基因计数：

featureCounts -a reference_annotation.gtf -o gene_counts.txt sorted_output.bam

• reference_annotation.gtf 是 GTF 注释文件。
• gene_counts.txt 是输出的基因表达计数文件。

差异表达分析：

你可以将 featureCounts 生成的计数矩阵导入 edgeR 或 DESeq2 等 R 包中进行差异表达分析。

完整的 RNA-Seq 分析流程

# 1. 数据准备 (sratoolkit)
fastq-dump --split-files SRRXXXXXXX

# 2. 构建基因组索引 (HISAT2)
hisat2-build reference_genome.fasta reference_index

# 3. 序列比对 (HISAT2)
hisat2 -x reference_index -1 reads_1.fastq -2 reads_2.fastq -S output.sam

# 4. 转换为 BAM 文件并排序 (SAMtools)
samtools view -bS output.sam > output.bam
samtools sort output.bam -o sorted_output.bam
samtools index sorted_output.bam

# 5. 表达定量 (StringTie)
stringtie sorted_output.bam -G reference_annotation.gtf -o output.gtf

# 6. 基因计数 (subread)
featureCounts -a reference_annotation.gtf -o gene_counts.txt sorted_output.bam

总结

• sratoolkit：用于从 SRA 数据库下载 RNA-Seq 数据。
• HISAT2：用于将 RNA-Seq 数据比对到参考基因组。
• SAMtools：用于处理 SAM/BAM 文件，包括转换、排序和索引。
• StringTie：用于转录组组装和表达定量。
• subread：用于基因计数和生成差异表达分析所需的计数矩阵。

你可以根据实际数据和实验设计灵活调整流程。如果有任何具体步骤需要进一步解释或帮助，请告诉我！

E:\I\工作\打包exe4\exe\sratoolkit.3.0.10-win64\bin>fastq-dump.exe –split-files SRR4029466

图2

代码：

执行命令: “E:\I\工作\打包exe4\exe\sratoolkit.3.0.10-win64\bin\prefetch.exe” SRR4029466 SRR4029465 SRR4029464 –output-directory “F:/ARK”

perfetch

import os
import subprocess
import tkinter as tk
from tkinter import messagebox, filedialog

设置 prefetch.exe 的路径

prefetch_path = r”E:\I\工作\打包exe4\exe\sratoolkit.3.0.10-win64\bin\prefetch.exe”

创建 Tkinter 窗口

root = tk.Tk()
root.title(“Prefetch SRR Downloader”)
root.geometry(“400x250”)

标签提示

label = tk.Label(root, text=”请输入要下载的 SRR 文件编号（用空格分隔）：”)
label.pack(pady=10)

文本框，用于输入 SRR 文件编号

srr_input = tk.Entry(root, width=50)
srr_input.pack(pady=10)

选择目录的文本框

output_dir_label = tk.Label(root, text=”选择输出文件夹：”)
output_dir_label.pack(pady=10)
output_dir_input = tk.Entry(root, width=50)
output_dir_input.pack(pady=5)

浏览按钮，选择输出文件夹

def browse_folder():
folder_selected = filedialog.askdirectory()
output_dir_input.delete(0, tk.END) # 清除当前的路径
output_dir_input.insert(0, folder_selected) # 插入选择的路径

browse_button = tk.Button(root, text=”浏览…”, command=browse_folder)
browse_button.pack(pady=5)

下载函数

def download_srr():
srr_files = srr_input.get().strip()
output_dir = output_dir_input.get().strip()

if not srr_files:
    messagebox.showwarning("警告", "请输入至少一个 SRR 文件编号！")
    return

if not output_dir:
    messagebox.showwarning("警告", "请选择输出文件夹！")
    return

try:
    # 拼接命令，假设 prefetch.exe 支持 --output-directory 参数
    command = f'"{prefetch_path}" {srr_files} --output-directory "{output_dir}"'
    print(f"执行命令: {command}")
    
    # 使用 subprocess 调用命令行
    result = subprocess.run(command, shell=True)
    
    # 检查是否成功
    if result.returncode == 0:
        messagebox.showinfo("完成", "文件下载成功！")
    else:
        messagebox.showerror("错误", "文件下载失败！请检查 SRR 编号是否正确。")
except Exception as e:
    messagebox.showerror("错误", f"执行命令时出错: {e}")

按钮，用于触发下载

download_button = tk.Button(root, text=”开始下载”, command=download_srr)
download_button.pack(pady=20)

运行 Tkinter 窗口

root.mainloop()

执行命令: “E:\I\工作\打包exe4\exe\hisat2-2.2.1\hisat2-build-l.exe” “E:/I/工作/打包exe4/test/GallusGRCg7b.dna.fasta” “gallus”

图3